三种方法检测耐甲氧西林葡萄球菌方法的评价

【关键词】  耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；头孢西林纸片扩散法；微量稀释法

　　［摘要］ 目的：评价3种检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)方法的临床应用价值。方法：用头孢西丁纸片扩散法，苯唑西林微量稀释法和PCR检测mecA基因对临床分离98株葡萄球菌进行检测并作比较。结果：98株中有63株耐甲氧西林葡萄球菌，3种检测方法差异无显著性。结论：头孢西丁纸片扩散法可作为基层医院微生物实验室日常工作检测甲氧西林的简便又准确的实验方法。

　　［关键词  耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；头孢西林纸片扩散法；微量稀释法

　　葡萄球菌是人类感染的最重要的病原菌之一［1］，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin　resistant staphylococcus aureus，MRSA)所造成的院内感染一直是临床普遍关注的问题，而凝固酶阴性的耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant oaagulase megative staphylooocci，MRCNS)近年来报道增多，其耐药性比凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌更高，造成临床治疗上的困难。由耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant staphylooocci，MRS)引起的感染已经成为临床抗感染治疗的难题之一。怎样快速、准确地检测出MRS及预测其耐药性变化对临床治疗及合理应用抗生素都有十分重要的意义。为此，我们对MRS的检测方法进行了探讨，现报告如下。

　　1　材料与方法

　　1．1　材料

　　1．1.1　菌株来源　收集了2005年9月至12月本院临床科室各类标本中分离的葡萄球菌共98株，并经血浆凝固酶试验和法国生物梅里埃公司生产的VITEK32全自动微生物分析仪系统，配套的GPI和GNI细菌鉴定板鉴定，严格按照细菌鉴定程序进行。金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923。

　　1．1.2　主要试剂　GPI细菌鉴定板和GPS药敏板条为法国生物梅里埃公司产品。头孢西丁(30 μg)纸片为英国OXOID公司商品，药敏试验所用培养基MuelleHinton(MH)琼脂购自杭州微生物试剂厂。mecA基因检测引物由上海生物工程公司合成。

　　2　方法

　　2．1　最低抑菌浓度(MIC)测定　用GPS-109药敏鉴定卡在Vitek32全自动微生物分析/药敏系统测定苯唑西林MIC，遵循美国临床和实验室标准化研究所CLSI制定的判断标准。

　　2.2　头孢西丁纸片扩散试验　按CLSI推荐的Kirby-Bauer法进行，菌液浓度0.5麦氏浊度(1.5×108 CFU／ml)。结果判断标准：金黄色葡萄球菌抑菌圈直径≤19 mm为耐药，≥20 mm为敏感，凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径≤24 mm为耐药，≥25 mm为敏感。

　　2．3　PCR检测mecA基因　挑取菌落置入内含有100 μl生理盐水的0.5 mL离心管内，离心(15 000 r／min)5 min吸弃上清液加裂解液A(0.5%非离子去污剂)50 μl和裂解液B(200 ug／ml蛋白酶K)5 μl置55 ℃保温1 h后置入95 ℃保温5 min。离心(10 000 r／min)30 s，上清液即为模板。PCR引物序列P1(5’-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3’)，P2(5’-AATGGGACCAACATAACCTA-3’)，PCR反应体系50 μl，热循环参数为：94 ℃预变性5 min,94 ℃1 min，48 ℃1 min，72 ℃1 min，循环30次，72 ℃延伸10 min，PCR扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶电泳成像仪下观察，以224 bp处出现荧光条带为mecA基因阳性。金葡菌ATCC 25923作为阴性对照，阳性对照模板DNA由上海生物工程公司提供。

　　2　结果

　　98株耐甲氧西林葡萄球菌3种方法检测结果见表1，以mecA基因检测呈阳性为“金标准”共检测出63株耐甲氧西林阳性的葡萄球菌。三种检测方法经χ2检验差异无显著性(χ2=0.265，P>0.05)。

　　表1　三种耐药检测方法阳性结果比较(略)

　　3　讨论

　　目前临床上由于MRS的出现致使感染趋势不断上升，多重耐药性增加，现有的抗生素很难控制这些耐药菌株的感染，给临床上的治疗带来的困难。正确快速的检测MRS并找出有效控制其感染的药物，是目前临床微生物工作的任务之一。MRS检测方法有核酸探针技术――PCR检测法，VITEK仪器测定最低抑菌浓度(MIC)和CLSI推荐鉴定的葡萄球菌的头孢西丁纸片扩散试验等方法。为了寻找出适合基层医院实验室检测耐药性的简单而又可靠的方法，我们用头孢西丁纸片扩散法和苯唑西林微量稀释法与mecA基因的PCR检测法进行了比较，并评价了它们的可靠性与临床应用价值。本试验结果显示三种方法差异无显著性，所以此三种方法均为检测MRS的可靠方法。本文中PCR检测mecA基因方法被公认为检测葡萄球菌的“金标准”［2］，其具有快速、简便、特异性强和敏感性好的特点。并能够检测出异质性耐药的菌株，但由于PCR扩增仪等仪器设备的限制，在基础常规实验不易开展。而VITEK仪器测定苯唑西林MIC方法虽然操作简单，但由于需要VITEK仪器，在基层医院实验室也不易开展。头孢西丁纸片扩散法的敏感性和特异性均较高，实验条件无特殊要求，且由于头孢西丁属头霉素类抗生素，对金黄色葡萄球菌产生的β内酰胺酶稳定，并且与金黄色葡萄球菌的PBP4有高亲和性，可检测低水平、异质性耐药MRS菌株，因此临床实验室可常规使用头孢西丁纸片扩散法进行MRCNS筛检。综合本实验所用的3种检测方法，均可作为检测MRS的可靠方法，但从操作过程，仪器设备，实验条件，结果敏感性和特异性综合考虑基层临床实验室可常规使用头孢西丁进行MRS的进行筛选。

　　参考文献：

　　［1］　孙彦．彭丽梅，李绪黎.医院感染中常见病原菌耐药分析［J］.临床和实验医学杂志，2005，4(2)：7982．

　　［2］　Murakami K，Minamide W，Wada K，et al，Identificationof methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaetion［J］．J Clin Microbiol，1991，29(10)：22402244．