血小板抗原基因的分型与配型临床疗效

                       作者：林国连　高发平　陈雅雯

【关键词】  血小板

　　摘要：目的：血小板基因分型及配型的探导，以便确定临床血小板输注的安全和疗效。方法：应用聚合酶链序列特异性引物技术（PCR－SSP），对湛江市72例患者（人血小板抗原）的HPA1-5系统等位基因进行分型，由湛江市血液中心提供相配型的血小板为其进行成份血小板输注。结果：经血小板基因配型的吻合组血小板输注后CCI1、CCI24效果明显优于对照组。结论：对血小板基因分型与配型可以提高临床输注血小板的安全性和疗效。

　　关键词：人血小板抗原；基因分型；配型；临床疗效

　　The Genotype Matched-type and Clinical Effect of Platelets Antigen Gene

　　Abstract: Objective: To research the genotype and the matched-type of platelets antigen gene for making sure the clinical effect of the platelets inject. Method: Divide HPA1-5 system accede of 72 patients in Zhanjiang by the technique of PCR-SSP. The inject matched-platelets with provided by the blood center of Zhanjiang for patients. Result: The group injected the matched genotype platelets in the effect of CCI1.CCI24 were better than the compared one. Conclusion: To divide the genotype and match the type of  platelets can improve the safety and curative effect of the platelets injection.

　　Key words: Platelets antigen;  The genotype; Matched-type; Clinical effect
                                                                                           
　　国外近年来经大量研究后发现，HPA（人血小板抗原）在新生儿血小板减少性紫癜，输血后紫癜，和经血小板输注后无疗效等疾病中具有重要意义［1～2］。特别在临床上，许多血小板减少性紫癜患者，因血小板输注疗效很差，并发出血等，更有甚者导致死亡等严重后果。因此，有必要对血小板抗原基因分型及配型进行深入的探导。一直以来，医学上一直用传统的血清学方法进行HPA分型，由于缺乏高质量、高效价抗血清等等多种因素的制约，始终无法对HPA进行分型。随着对HPA基因的深入研究，国外近年来己报道［3～6］将基因检测技术用于血小板分型研究中，经临床配型输注取得较好的效果。本文应用聚合酶链－序列特异性引物技术（PCR-SSP）对湛江市区72例患者的HPA1-5系统等位基因进行了分型，并提供基因型相合的血小板成份进行输注，现报告如下。　

　　1 材料与方法

　　1.1 检测标本：抽取185名湛江市区的健康军人献血者以及72例需输注血小板的患者静脉血1m1（EDTA抗凝）。

　　1.2 主要试剂和仪器 Taq  DNA聚合酶由Promega公司提供,HPA1-5系统等位基因特异性引物由美国C&T公司提供,DNA提取采用德国QLAmp  DNA  Mini  kit,扩增仪为澳大利亚RG公司3000型WVSR分析仪。

　　1.3 DNA提取：采有德国QIAamp  DNA  Mini  Kit从全血中提取DNA，操作按机器说明书进行。

　　1.4 PCR－SSP特异性HPA基因扩增

　　1.4.1 PCR反应体系：反应体系共10μl，包括反应混合液（含特异性HPA1a～HPA5b基因引物，内对照引物,Dntp、PCR缓冲液等）8μl，提取的基因组DNA1μl及含0.6U TaqDNA酶液1μl。

　　1.4.2 PCR扩增参数：首先以95℃5min变性；然后按95℃ 30S，60℃ 60 S，72℃90 S扩增，共45个循环。

　　1.4.3 扩增产物鉴定：PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下观察结果。

　　1.5 临床HPA基因吻合组与末配型组输注成份血小板的疗效比较果：将需要输注血小板的患者分为基因吻合者（吻合组）及末配型者（对照组）两组，分别在输注前、输注后1h和24h进行血小板计数，同时记录输入的血小板数总量及患者的体表面积。计算血小板输注后1h、24h患者纠正的血小板计数增值（CC1）［7］，比较两组的有效率。

　　2 结果

　　2.1 对185名湛江市区的健康军人献血者进行HPA基因分型，其ABO血型、HPA基因型分布情况见表1。

　　2.2 对72例需输注血小板的患者进行HPA基因分开型，其ABO血型、HPA基因型分布情况，见表2。

　　2.3 对湛江市区72例需输注血小板患者进行血小板基因分型并选择，由湛江市血液中心提供HPA基因相吻合的血小板输注。共收到临床反馈资料60份，其中基因型吻合者（吻合组）29份，未配型者（对照组）31份。吻合组与对照组血小板输注后1h、24h平均CCI值见表3。对吻合组及对照组血小板输注后1h、24h的输注有效率进行了比较［8］，结果见表4。

　　3 讨论
 
　　血小板抗原在临床输血中有着重要的意义。血小板抗原不合，可导致血小板输注后疗效差别很大，或者无效，输成份血小板后引起紫癜，以及引起新生儿血小板减少性紫癜等等。要想输成份血小板有满意疗效，必须对血小板抗原基因分型及配型。近年来，国外对血小板抗原基因分型进行很多研究。我国大部分地区没开展此项技术的研究工作，临床上大部分地区没有对血小板抗原基因分型及配型。导致临床上输血小板的疗效不很满意，甚至出现负作用。因此希望广大医务工作者在此方面加倍努力。对湛江市185名献血员的HPA1-5系统等位基因进行分型，可建立一个小资料库，为临床输注成份血小板的患者提供配型相合的成份血小板。对提高输血小板疗效有很大的帮助，还可以对血小板特异性抗体进行鉴别。对湛江市72例患者进行的HPA的基因分型及配型，从收集回的60例疗效来看，基因吻合组输血小板后1h、24h的平均CCI值比对照组显著升高。从两组疗效来看吻合组输注血小板后1h、24h有效率

　　表1 湛江市185名献血者ABO血型、HPA基因型分布　略

　　均为100%，而对照组则为83.9%和80.6%，明显不及吻合组。目前临床上输注血小板只考虑ABO血型相同，（实际工作中，由于病情急，且血源受限制时，血型不同也会输注血小板，这情况结果，本人在另一编文章中已述）而忽视HPA配型。对那些需反复多次输注血小板者，更应进行HPA的基因分型，以便提高输血小板的安全和疗效。

　　表2 湛江市72例患者ABO血型、HPA基因型分布　略

　　参考文献：

　　［1］williamson L M,Hacket G,Pennie J,et al.The natural history of fetomatrnal  alloimmunization to the platelet-specific antigen HPA-la as determined by antenatal screening［J］.Blood,1998，92:2280.

　　［2］Kickler T S.Platelet immunology.In:Anderson K L, Ness P M.eds.Scientific Basis of Transfusion  Medicine［M］.Philadelphia:WB Saunders,1994.304.

　　［3］Metcalfe P,Cavanagh G,Hurd C,et al,HPA genotyping by PCR-SSP:Report of 4 exercises［J］.Vox Sang,1999，77:40.

　　［4］Skogen B,Belissimo D B,Hessner J M,et al.Rapid determination of platelet alloantigen genotypes by PCR using allele-specific primers［J］.Transfusion,1994,34:95．

　　［5］Cavanagh G,Dunn A,Chapman C E,et al.HPA genotyping by PCR-SSP:A streamlined method for rapid  routine investigations［J］.Transfus Med,1997,41.

　　［6］Chen D F,Pastucha L T,Chen H Y,et al,Simultaneous genotyping of human platelet antigens by hot start sequence-specific polymerase chain reaction with DNA polymerase AmpliTaq gold［J］.Vox Sang,1997,72:192.

　　［7］王培华.输血技术学［M］.北京:人民卫生出版社,1988.182-183.

　　［8］孟钵,张益红,等.血小板抗原基因分型及配型的研究与初步应用［J］.临床检验杂志,2001,19(4):207