pf4及相关肽基因重组腺病毒的构建 |
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pf4及相关肽基因重组腺病毒的构建 收藏此文
全部作者 ： 吴立华 刁世勇 蔡英林 李妍涵 顾洁 任倩 李彬 杨仁池 韩忠朝
第一作者单位 ： 中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所
论文摘要 ： 目的 利用细菌内同源重组法构建含pf4（血小板第四因子）全长1-70及pf4的小肽17-70基因重组腺病毒。方法 用pcr方法从我室构建含pf4全长及pf4的小肽17-70基因的原核表达载体中调出两个基因片段而后再用pcr方法与mcp-1信号肽连接并扩增，用酶切基因片段亚克隆至同样酶切的腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv中，形成转移质粒padtrack-cmv(pf4-1-70)和 padtrack-cmv(pf4-17-70)，将之用pmei酶切线性化后与腺病毒基因重组质粒padeasy-1 共转化大肠杆菌bj5183，抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒，paci酶切后用磷酸钙共沉淀方法转染293细胞，包装成重组体腺病毒ad(pf4-1-70)和ad(pf4-17-70)。采用pcr方法对重组体腺病毒进行鉴定，反复用293细胞扩增并用氯化铯密度梯度纯化病毒,用tcid50方法测病毒滴度，利用同时购买的带有lacz报告基因的对照重组腺病毒（ad- lacz）对感染效率进行监测。结果 利用电穿孔法分别将质粒padtrack-cmv(pf4-1-70),padtrack-cmv(pf4 - 17-70)与质粒padeasy-1共转化大肠杆菌bj5183获得70%以上的阳性重组体细菌克隆。pcr检测结果表明重组腺病毒已含有目的基因，滴度为1010tcid50/ml。结论 细菌内同源重组法构建腺病毒相比于传统的细胞内同源重组法，具有成功率高、方法简便、快捷、实验周期短的优点，值得进一步推广使用。
关键词 ： 腺病毒；pf4；相关多肽；同源重组；细菌
发表日期 ： 2008年01月15日
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