内毒素激活巨噬细胞的信号传导

　　摘要　脂多糖（LPS）通过与膜受体CD14作用将信号从胞外传到胞核而刺激多种细胞合成和释放TNF-α、IL-１和IL-6等生物活性物质而表现复杂的生物学活性，但其详细机制尚未完全清楚。本文就近年来对LPS激活巨噬细胞的信号传导机制的研究作一简要综述。

　　关键词:内毒素；信号传导；内毒素结合蛋白；蛋白酪氨酸激酶

　　内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成份，其化学本质为脂多糖，为细菌死亡或活跃繁殖时所释放。LPS本身无毒性作用，但能够刺激体内多种细胞合成并释放众多内源性生物活性因子而表现出生物学活性。

　　内毒素由结构和功能不同的四部分组成：0-物异侧链、外核心、内核心和类脂A。类脂A是LPS的生物学活性组份，人工合成的类脂A具有LPS的所有生物学活性，因此，细胞对类脂A的识别必是LPS诱导细胞反应的起始步骤。不同革兰氏阴性细菌来源的类脂A的化学结构高度保守，对其组成已了解得比较清楚。然而，对LPS的三维结构及具有活性的构象知之甚少，对其与脂多糖结合蛋白（LBP）和/或CD14结合时的构象更无研究。因为是它们介导了激活细胞的信号传导，对这些复合物结构的研究会更有意义。信号由CD14介导从胞外传到胞内后，最终将导致基因转录事件的发生，LPS至少使哺乳动物20种以上基因发生转录，只有充分认识此信号传导途径，才能综合利用各种手段控制由内毒素引起的不良反应。

　　1 LBP的结构和功能

　　LBP的发现是近几年来研究LPS如何刺激细胞过程中最重要的突破。1986年，Tobias等[1]首次从兔急性反应血清中分离纯化出LBP，酶联免疫吸附试验表明LPS通过类脂A与LBP结合，核心多糖和0-抗原对其无影响，结合比例为1：1。人LBP是由肝细胞合成的单链多肽，糖基化后以60KDa的糖蛋白进入血流，合成受细胞因子和类固醇激素的调节。LBP与另外一种LPS/类脂A结合蛋白即细菌穿透增高蛋白（BPI）具有较高同源性，氨基酸序列分析表明LBP和BPI与其它脂类载体蛋白具有部分相同序列，可以断定LBP是结合中级两性分子并在亲水环境中运输这类分子的蛋白家庭一员。

　　LBP最重要的生物学功能是使LPS与CD14结合。它有两个功能域，一个与LPS结合，另一个介导LPS与CD14的相互作用。BPI的LPS结合功能区位于氨基末端的25kDa片段，氨基末端的蛋白水解片段和切割突变片段都有结合LPS的功能。在这启示下，现已发现LBP的氨基末端片段LBP1-197也显示出与LPS的结合能力，然而，LBP1-197缺乏提呈LPS与CD14的能力，并且不能代替LPS刺激THP-1细胞株产生TNF-α，但能有效抑制LBP依赖的LPS与CD14的结合及刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α。虽然BPI与LPS结合的亲和力大于LBP，但它不能促进LPS与CD14的结合，说明BPI缺乏参与LPS提呈的功能域或LPS与CD14的较大亲和力抑制了此作用。

　　LBP能提高类脂A刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α的灵敏度和反应性，也能增强LPS诱导其它细胞因子和NO的产生。去除血浆中的LBP能抑制LPS激活细胞的功能，体内实验也表明抗-小鼠LBP抗体能阻止LPS引起的小鼠死亡。但另一方面，LBP在LPS或革兰氏阴性菌引起的免疫保护反应中起了至关重要的作用，LBP-/-小鼠对LPS或革兰氏阴性菌的抵抗力明显低于正常小鼠[2]。可见，LBP在对LPS免疫应答中的作用是双方面的。

　　2 CD14介导细胞激活的信号传导

　　LPS-LBP复合物需进一步与CD14结合才能刺激细胞，使信号向胞内传递而表现出生物学活性。作为LPS受体，CD14以两种形式存在：①由甘油磷脂酰肌醇尾巴（GPI）锚定在单核巨噬细胞表面（mCD14），②缺乏GPI的可溶性CD14（sCD14）。与GPI结合的CD14羧基端的具体位置尚未确定。sCD14有多条生成途径，在磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C作用下，CD14阳性细胞能释放此分子；CD14也能通过蛋白酶从膜上降解；一种磷脂酶D也能催化CD14的释放，但其作用还不清楚；CD14还可以由髓系细胞直接分泌。

　　LBP作为一种调理素，促进LPS与髓系细胞的结合。E-LPS和LBP混合，就和 单核巨噬细胞形成玫瑰花现象，预先用抗-CD14单抗或磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C处理细胞就能阻止玫瑰花的形成，并且，当抗-CD14单抗事先加入全血中，再加入LPS，在一定浓度范围内就无刺激产生细胞因子的能力。

　　虽然，LBP/CD14途径的阐明，是对LBP刺激细胞机制认识的一个飞跃，但同时也提出了许多目前无法回答的问题。最根本的问题是：象CD14这种GPI锚定的分子，本身并不直接与细胞内其它分子交换信息，是如何介导信号传导的？目前普遍认为LPS受体是多种分子的聚合体，而mCD14只是其中的配基结合亚单位，跨膜信号的传递由其它亚单位来执行。现已有不少证据支持这一假说。Hazio[3]等发现，LPS诱导铜蓝蛋白、LBP等急性时相反应蛋白的表达并不需要CD14的存在。但当LPS通过非CD14依赖途径发挥生物学功能时，通常需要超一定剂量的高浓度。抗-CD14单抗对LPS激活髓系细胞的抑制功能只有在低于一定浓度的LPS条件下有效。有人研究了表达GPI锚定的或膜整合形式的CD14的70Z/3细胞[4]，LPS对这两种细胞都有激活功能，因此，GPI本身对CD14参与信号传导并不重要，只使CD14与胞膜整合。

　　对sCD14的研究较少，一般认为它在LPS刺激内皮细胞、上皮细胞等本身无mCD14的细胞中起了一定作用[5]。

　　3 内毒素激活巨噬细胞的胞内信号传导

　　在内毒素刺激细胞的胞内信号传导途径中，研究最多的是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），多种因素都能激活此途径，尤其是多肽生长因子。LPS与CD14的结合导致蛋白酪氨酸激酶（PTK）的活化，从而激活下游的MAPK。一些实验表明，PTK抑制剂能抑制LPS诱导巨噬细胞产生TNF-α、IL-β及其杀瘤细胞活性[6]。Src酪氨酸激酶家族成员p53/56Lyn（可能与胞膜相连）能被LPS激活，并导致其自身磷酸化一过性减少而后增加[7]。其它被LPS激活的酪氨酸激酶包括p58/64hck和p59c-fgr等。但最近，Meng等[8]发现hck-/-fgr-/-lyn-/-小鼠来源的腹腔和骨髓巨噬细胞对LPS刺激产生IL-1，IL-6和TNF-α的反应皆正常，他们认为，LPS可能是激活了其它酪氨酸激酶如p72syk等。Raf-1能和ras直接作用而激活MAPK，通过ras依赖或非依赖途径，BAC-1.2F5巨噬细胞受LPS刺激导致Raf-1的快速磷酸化而活化，而酪氨酸磷酸化抑制剂，抑制Raf-1/MAPK的活化，表明它们的激活发生在PTK之后。

　　介导LPS信号传导的另一种途径是神经酰胺，它是由神经鞘磷脂酶催化神经鞘磷脂水解而生成。神经酰通过神经酰胺激活的蛋白激酶（CAK）而传递信息。CAK也能激活Raf[9]，这又提供了一条进入MAPK途径的通道。LPS直接激活神经酰胺信号传导途径的依据有：①类脂A和神经酰胺结构相似，②神经鞘磷脂酶和透细胞性的神经酰胺类似物能诱导巨噬细胞对LPS的部分反应，③LPS依赖于CD14而激活CAK，④来源于C3H/HeJ小鼠（内毒素耐受）的腹腔巨噬细胞对神经酰胺无反应。

　　另外，PKC、C蛋白等信号传导途径在内毒素激活细胞中也起重要作用[6，10]。但由于内毒素生物学效应的多样性、细胞来源的不一致性、检测传导途径指标的不同及各种传导途径相互联系，致使对其研究显得十分困难。

　　4 与内毒素激活细胞有关的转录因子和反应元件

　　转录因子家族Ets由三十种以上蛋白质组成，存在于多种生物，DNA结合部分为位于羧基末端含85个氨基酸残基的高度保守序列。Ets通过识别富含嘌呤的10对碱基对而调节目的基因的转录，TNF-α、IL-1β等多种LPS诱导的基因启动子中存在Ets结合位点。目前已证实Ets-2、Elk-1可由LPS诱导，而它们恰好又是MAPK信号传导途径的作用点[11]，酪氨酸激酶抑制剂genestein能阻止LPS导致其磷酸化[12]。Ets家族的另一成员Pu.1只表达在巨噬细胞和B淋巴细胞[13]，因此，Pu.1有可能是介导巨噬细胞特异基因表达的转录因子。

　　许多LPS反应基因都有κB/rel转录因子家族识别的位点，核转录因子NF-κB通过识别保守序列5′GGG（ATrich）5CC3′在许多细胞中诱导多种基因的转录。NF-κB是调节 转录活性的多基因家族，其成员包括NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52/p49）、RelA（p65）、c-rel和relB。保守区域rel控制其与DNA结合、二骤化和核移位。在静息细胞中，NF-κB与其抑制因子IκB形成无活性的胞浆复合物，生长因子、丝裂原等使IκB磷酸化而使NF-κB释放出来并进入核内，LPS激活巨噬细胞也是如此。IκB也是多基因家庭，至少包括MAD3/IκBα、IκBγ和bcl-3，它们与rel的结合有特异性。但仅是NF-κB的激活对内毒素刺激细胞的信号传导是不够的，LPS能激内毒素刺激细胞的信号传导是不够的，LPS能激活内毒素反应正常和内毒素耐受小鼠来源巨噬细胞的NF-κB，但只能使内毒素反应正常小鼠的巨噬细胞表达TNF-α和iNOS。最近，Xie[14]报道LREAA（一种脂多糖反应元件）结合蛋白的激活在LPS刺激巨噬细胞产生iNOS是必需的。其它转录因子，如NF-IL6等在LPS刺激细胞中的作用也有涉及，但其具体细节不清。

　　5 结语

　　由于LPS发挥生物学效应的配基的复杂性、新受体的发现、不同巨噬细胞反应的不同及与其它信号传导途径相互联系，以至于对其激活细胞的信号传导机制研究的进展并不令人满意。许多信号传导途径并非LPS激活细胞所特有，而往往与其它信号传导途径相互交叉。目前迫切的任务是找到LPS激活细胞特有的信号传导途径，但如果巨噬细胞的基因调节是由多条途径相互作用，这种努力也许将最终失败。

　　参考文献

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