与细胞凋亡相关的蛋白酶研究进展

　　摘要 目前国内外许多学者都逐渐认识到细胞内蛋白酶与细胞凋亡密切相关，认为这些蛋白酶可能在细胞凋亡的启动方面起着关键性作用。本文就这些蛋白酶的种类，底物及其抑制剂的作用作一综述。

　　关键词：细胞凋亡；白介素1转换酶；蛋白酶

　　1 概 述

　　细胞凋亡是区别于细胞坏死的一种细胞死亡形式，它是在一定的生理和病理条件下，一种并不引起机体炎症反应的细胞程序性死亡（programmed cell Death, PCD）的过程。细胞凋亡这一概念最早由Kerr等提出的[1]，认为该种细胞死亡像秋天的树叶凋谢一样，故称谓“Apoptosis”，希腊文即凋亡之意。细胞凋亡在形态学和生化改变方面具有特征性。形态学改变包括细胞皱缩，染色质浓缩，核裂解成碎片，最终细胞膜及内质网膜将完整细胞器及碎片包裹成多个分散的凋亡小体。生化改变以往认为内源性核酸内切酶活性增加染色质核小体间DNA断裂是引起凋亡的一个启动因子，但有些具有细胞凋亡特征性改变的却没有染色质核小体间DNA断裂，有的甚至缺乏细胞核[1]，看来仅仅以此酶活性增加作为凋亡的启动因子，不能得到满意的解释。目前许多学者都着重于对细胞内蛋白酶的研究，认为这些蛋白酶可能在细胞凋亡的启动方面起着关键性作用。研究依据为：（1）在细胞凋亡早期已发现特异的、可复制的细胞内蛋白的降解[2]。（2）某些蛋白酶抑制剂可抑制细胞凋亡的发生[3]。（3）部分病毒蛋白质作用类似蛋白酶抑制剂，可以抑制细胞凋亡[4]。（4）基因删除实验证明某些蛋白酶在细胞凋亡中起着主要作用[5]。

　　2 白介素1转换酶家族（ICE家族）

　　在蛋白酶的研究中，研究得最早且最多的为白介素1转换酶（Interleukin 1 converting enzyme, ICE）是巯基蛋白酶的一种。ICE的作用是将无活性的31KD的前白介素1（在天冬氨酸羧基端降解为有活性的17.5KD的细胞因子。ICE由Black等和Kostura等[6]在1989年发现，此酶有高度的底物特异性。ICE高度表达导致细胞死亡，而ICE抑制剂如痘苗病毒CrmA可抑制由各种不同刺激因子诱导的细胞凋亡[7]。在线虫C.elegans的遗传学研究中发现1090个细胞中131个细胞出现了预定的细胞凋亡，调控该程序性死亡的基因已被确认。基因删除实验证明有2个基因ced-3和ced-4是引起细胞凋亡所必需的。尽管由ced-3编码的多肽其功能还不十分清楚，但这一分子显示与人类ICE有广泛的相同部分，ced-3蛋白与ICE有29%氨基酸残基同源性。ced-3蛋白最长的保护顺序QACRG含有ICE活性所必需的半胱氨酸。14C碘乙酰胺标记和晶体学研究[8]均发现ICE活性位于半胱氨酸残基，此基团在催化作用中起着关键作用。活性型ICE是一个四聚体，由两个20KD和两个10KD亚基因组成。它是由无活性型的45KD酶原在天冬氨酸-X连接处降解成20KD和10KD亚基。晶体学研究提示2个亚基均是酶活性所必需的[8]。由于ced-3蛋白和ICE间29%同源性促使对包括人类的哺乳类细胞凋亡过程中ICE作用的研究，已发现鼠成纤维细胞中ICE过度表达引起细胞凋亡。若涉及ICE催化活性半胱氨酸和甘氨酸基团突变，则导致催化活性和诱导转染细胞凋亡的功能的丧失。由ATP诱导的鼠腹膜巨噬细胞凋亡及亚胺环已酮及肿瘤坏死因子诱导的Hela细胞凋亡过程中均发现有成熟的白介素1释放[9]，提示ICE在细胞凋亡中被激活。目前对于与ICE活性有关的特异性底物还不十分清楚。随着研究的不断深入，ICE家族成员不断扩大，统称为ICE同类物（ICE homologues）。包括：1）Nedd-2，最初从鼠大脑细胞发育早期一组基因中发现的，后在人胎儿大脑细胞cDNA库中分离得到相同的基因，命名为Ich-1（即ICE和ced-3同类物-1），其编码蛋白顺序与ICE和ced-3相同[10]，Ich-1有两种不同的mRNA即长Ich-1和短Ich-1。长Ich-1过度表达诱导细胞凋亡。而短Ich-1过度表达抑制细胞凋亡。Ich和ICE相比不易被CrmA抑制[10]。2）CPP32与ced-3同源性为35%，与ICE同源性为30%，其在真核细胞内的表达能诱导细胞凋亡。CPP32又称为YAMA和apopain。CPP32的底物特异性不同于ICE。前者在P1-P4位点偏向性为四 肽DEVD＞YVAD，而后者偏向于YVAD。前者易被DEVD-醛所抑制，后者易被YVAD-醛抑制。CPP32能降解多二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP），ICE及长Ich-1并不降解PARP。3）TX（亦称为ICErelⅡ或Ich-2），与ICE有50%同源性，与ced-3有30%等同性[12]。该酶亦为巯基蛋白酶，能催化降解30KD的ICE前体变为有活性的ICE[12]。TX在哺乳类动物细胞中的过度表达诱导细胞凋亡[12]。TX几乎不降解前白介素1。4）ICErelⅢ与ICE等同性为52%，与ced-3同源性为25%。该酶也不降解前白介素1，但仍使转染的Hela细胞发生凋亡。5）Mch2,是近年来发现的一个ICE家族成员，在氨基酸水平上与ced-3有35%等同性，与ICE有29%的同等性。Mch2不降解含有DEVD或YVAD产荧光的底物。Mch2底物的偏向性可能与CPP32或ICE的偏向性有很大不同。ICE家族偏向性成员的共同特性为：（1）这些蛋白酶参与催化降解作用依赖于P1位点的天冬氨酸，该特性与细胞毒T细胞特异的granzymeB有相同之处，后者为独特的丝氨酸蛋白酶。（2）这些蛋白结构均为多聚体，一般为四聚体，由大为17-22KD，10-12KD的亚单位组成。大小亚单位由单一的转录编码翻译成酶原，然后在各种天冬氨酸-X键处降解为两个亚单位。所有的ICE同类物都是具有相似的催化位点和相似的在等电点及天冬氨酸结合的部位。（3）这些蛋白酶均能自我催化或激活别的ICE同类物。由于在细胞凋亡过程中，ICE同类物并不是唯一的蛋白酶，许多描绘凋亡中蛋白酶的研究都是来源于蛋白酶抑制剂的研究，如TLCK、TPCK、TAME等，这些蛋白酶抑制剂抑制了与凋亡有关的各种细胞系统中DNA的降解[2，3，13]，故它们可能除了直接抑制ICE同类物外，还抑制ICE作用前或ICE作用后的蛋白酶（即非ICE蛋白酶）。

　　3 蛋白酶的底物特异性

　　近来研究显示在COS细胞内过度表达的ICE、TX和Nedd2可降解PARP[14]，PARP是目前较明确的底物之一。CPP32除了降解PARP外，还降解固醇反应元件结合蛋白SREBP-1和SREBP-2。所有这些发现都提示尽管在ICE家族中成员间有部分功能的重叠，但底物特异性可以有所不同。如体外实验纯化的ICE浓度在降解PARP比降解前白介素1要高出50-100倍。ICE的天然底物是前白介素1，降解产生有活性的白介素1，奇怪的是granzyme A也激活前白介素1[15]。尽管granzyme A降解前白介素1的位点与ICE降解前白介素1的位点不同，但两者激活的白介素1都具有生物学活性[15]，进一步证实了这样一个观点即存在不同种类的蛋白酶，其间有功能上的重叠。目前又发现层粘连蛋白（Laminin），能被称为LamP的假定为ICE同源物蛋白酶降解。层粘连蛋白是较明确的一个底物，由于它的降解作为细胞核凋亡的一个标志，LamP的激活可能是凋亡过程终末阶段的一个关键步骤。由于LamP至今还未被克隆化，到底其是否代表了ICE家族中的一个早已明确的成员？目前还不清楚。

　　4 iCE同类物间的相互作用

　　与ICE结构最相似的TX/ICErelⅡ和TX/ICErelⅢ（可能还包括其他成员）都不有效地降解前白介素1，这就意味着ICE主要作用是降解前白介素1，其它ICE同类物在过度表达时诱导细胞凋亡，由于这些蛋白酶在细胞凋亡中的作用的证据主要来源于其抑制剂的研究，而这些抑制剂如CrmA和AC-YVAD-CMK等并不具有高度特异性，其在不同程度上抑制所有ICE同类物，故不能区分到底是哪个蛋白酶在调节细胞凋亡中起主导作用。其次，CPP32可能降解PARP，Mch2也降解PARP及降解ICE，TX和Nedd2在足够浓度时也降解PARP，故假定哺乳类动物（包括人类）细胞凋亡途径涉及单一的某种ICE同类物似乎过于简单化，所有这些都提示ICE同类物间是互相作用协同参与细胞凋亡的。

　　5 各种蛋白酶间的作用模式

　　如上所述，在细胞凋亡过程中涉及各种不同的蛋白酶，那么它们是如何协调的呢？由于大部分蛋白酶的底物还不清楚，部分蛋白酶还没有被确认，因此要设想一个包容所有发现的单一模式似乎不可能。但不管怎样，这些蛋白酶间的相互作用必为以下两种模式的一种或不同阶段以不同模式出现。（1）蛋白酶是同时被激活的，对凋亡信号的反应是彼此 独立的，蛋白酶间没有各种级别。（2）有级别的一系列级联和/或连锁反应。到底是何种模式，还有待于进一步研究。

　　6 蛋白酶抑制剂的作用

　　细胞外蛋白酶活性受内源性蛋白酶抑制剂高度调节，细胞内蛋白酶抑制剂已被发现。尽管后者被认为在调节细胞凋亡中起重要作用，但目前才开始受到重视。病毒serpin crmA的表达显示能抑制由神经生长因子撤除诱导的脊髓背根神经节神经元的凋亡，还能抑制Fas配体和TNF诱导的不同类型的细胞株的凋亡[9，11]。目前还不清楚CrmA的抑制凋亡是由于ICE、CPP32的抑制或其它关键蛋白酶的抑制。近来又发现nexin1（另一种serpin）也可抑制自发的和axotmy诱导的小鸡脊髓运动神经元的凋亡，血浆蛋白溶酶原激活抑制剂2（亦为serpin的一种），也显示抑制TNF诱导的细胞凋亡。有趣的是，最近发现用热诱导的FM3A细胞，用半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和天冬氨酸蛋白酶抑制剂pepstatin a测定FM3A细胞的高热反应，结果显示在加热至44℃时出现显著的细胞毒效应，提示蛋白酶抑制剂可能诱导细胞凋亡，该现象与以往认为蛋白酶抑制剂是抑制凋亡的现象不符合。那么就出现这样一个问题：蛋白酶抑制剂是否存在双向调节？在什么情况下可能出现诱导细胞凋亡？

　　7 目前存在的问题

　　近年报道与细胞凋亡有关的蛋白酶，除了ICE家族外，还包括：（1）fragmentin/granzymes（2）丝氨酸蛋白酶；（3）calpains（4）ubiquitin依赖的蛋白降解作用[17]（5）降解体内巯基蛋白酶如组织蛋白酶D（cathepsin d）[18]和组织蛋白酶B（cathepsinB）等。

　　近来发现组织蛋白酶D（天冬氨酸酶类）能促使干扰素、FAS和TNF诱导的细胞凋亡，且是调控细胞凋亡的一个限速酶。其抑制剂pestatin a抑制该系统细胞的死亡[18]。目前我们消化所实验室也正在试图研究在两种不同的组织蛋白酶B表达的胃癌细胞株中的组织蛋白酶B抑制剂在细胞凋亡中的作用（待发表资料）。但是，我们尚缺乏足够的证据表明以上蛋白酶在细胞凋亡过程中涉及的细胞内底物的性质和种类。事实上，在细胞凋亡过程中，绝大多数的细胞内蛋白质并未降解。另一方面即蛋白酶的良好底物使问题更趋复杂化。因此，研究和确认与细胞凋亡相关的蛋白酶的细胞内底物及该底物在细胞凋亡中的作用对于加深我们对细胞凋亡机制的了解具有重要意义。

　　8 细胞凋亡相关蛋白酶研究的临床意义

　　众多研究表明一种或多种蛋白酶可能在细胞凋亡发生、发展过程中起关键性作用。研究者们已认识到蛋白酶和蛋白酶抑制剂可能为临床治疗某些疾病，延缓或加速细胞凋亡过程提供新的途径，例如可以应用一些蛋白酶抑制剂旨在延缓如缺血-缺氧所诱发的神经元、心肌肾脏上皮细胞的细胞凋亡进程。反之，可应用某些蛋白酶或某些蛋白酶激活剂（也有可能为某些蛋白酶抑制剂）来加速其细胞凋亡进程（如肿瘤等）。值得指出的是目前有关蛋白酶途径在细胞凋亡中治疗应用前景的讨论还仅仅是一种推测，还需要作大量的实验研究才能得到较明确的结论。

　　其中大致包括以下几个方面：

　　第一，需了解细胞凋亡相关蛋白酶在细胞内是如何被激活的？激活过程是如何完成的？阐明蛋白酶在细胞内被激活过程及其调控因素对于发现新的临床治疗途径会有帮助。

　　第二，如上所述，细胞凋亡过程可能会牵涉到多种蛋白酶的协同作用和连锁酶解反应。近来研究表明层粘蛋白酶酶解反应可能继PARP蛋白酶反应之后[19]。假定细胞凋亡涉及到多种蛋白酶的连锁酶反应（瀑布效应），那么发现位于连锁反应之首的蛋白酶将会为临床治疗提供独特的靶目标。

　　第三，对细胞凋亡相关蛋白酶基因调控机制及细胞内代谢过程目前了解甚少。近年研究表明，表达肿瘤基因bcl-2的细胞其IRP的激活明显减少[20]。实验结果表明bcl-2可能为IRP的抑制剂。

　　第四，对肿瘤细胞内细胞凋亡相关蛋白酶的表达及其调控目前研究甚少。一方面，bcl-2或其它未知基因产物所诱导的蛋白酶激活抑制与肿瘤细胞不易凋亡有关。另一方面 ，肿瘤组织内某些蛋白酶基因在的过度表达和调控失常在肿瘤细胞凋亡中所起作用也应值得进一步研究探讨。

　　参考文献

　　1 Steller H. science, 1995;267:1445-1449

　　2 Sarin A, adams DH, Henkart PA. J Exp, med, 1993;178:1693-1700

　　3 Bruno S, Bino gD, Lassota P, et al. Leukemia, 1992;6:1113-1120

　　4 Komiyama T, ray C, Pickup D, et al. J Bid. Chem, 1994;269:19331-19337

　　5 Kuida K, lippke J, Ku G, et al. Science. 1995;267:2000-2002

　　6 Kostura MJ. proc Natl. Acad. Sci USA, 1989;86:5227-5231

　　7 Enari M, Hug h, Nagata S. Nature, 1995;375:78-81

　　8 Walker NPC, talanian RV, Brady KD, et al. Cell, 1994;78:343-352

　　9 Miura M. friedlander RM, Yuan J. Proc Natl Acad Sci USA, 1995;92:8313-8322

　　10 Wang L, miura M, Bergeron L, et al. Cell, 1994;78:739-750

　　11 Tcwari M, quan LT, O’Rourke K, et al. Cell, 1997;81:801-809

　　12 Faucheu C, diu A, Chan A, et al. J, Emko 1995;14:1914-1922

　　13 Boekel JC, J immund, 1995;154:1707-1716

　　14 Gu Y, sarnecki C, Aldape RA, et al. J Biol. Chem, 1995;270:18715-18718

　　15 Irmler m,Herti g S, MacDonald HR. J. Exp. Med, 1995;181:1917-1922

　　16 Smyth MJ, trapani JA. Immunol. 1995;16:202-206

　　17 Ciechanover a. Cell, 1994;79:13-21

　　18 LoniS PD.J. emko 1996;15:3861-3870