全菌体灭活菌苗的现状和新策略

　　摘要 对全菌体灭活菌苗（WCV）防治传染病已进行了广泛的研究，WCV是预防疾病的一种经济、安全、有效的方法，但WCV的缺点是，胃肠外免疫能引起不良反应，而口服免疫常需大剂量，县免疫力短暂。近期研究表明，能提高WCV免疫原性和增强口服免疫应答的新方法极有希望提高这些菌苗的效力。

　　动物模型和人研究显示，WCV口服或胃肠外免疫均具有免疫原性，也具有预防呼吸道、肠道和全身性细菌感染的效力。虽然仅百日咳WCV被普遍应用，但其他WCV也具有普遍应用的潜力。本文报道了WCV研制的进展，重点阐述了制备更优质菌苗制剂的可能性。

　　肠道菌苗

　　空肠弯曲菌

　　空肠弯曲菌是引起胃肠炎的主要原因，估计全世界每年发病4亿多例。某些地区的罹患率高达2.5万~4万/10万。这种病原菌感染的主要后遗症是Guillain-Rarré综合征。一种传统的空肠弯曲菌菌苗已在动物中进行试验，这种菌苗（福马林和加热共同灭活，3剂）通过口饲给予小鼠，每剂间隔2天，并以大肠杆菌不耐热肠毒素（LT，25μg）为佐剂。免疫后4周在口服攻击模型中评估各种剂量的含和不含佐剂菌苗（105、107或109个细菌）的效力。用活空肠弯曲菌（108个细菌，100×半数定居量）攻击动物，并监测排菌情况。最大剂量菌苗和较小剂量含LT菌苗能预防定居，含或不含佐剂的菌苗均能预防细菌全身播散。两种配方的菌苗接种小鼠后，均检得空肠弯曲菌特异性血清IgA和IgG升高，但仅在含LT菌苗免疫小鼠中检得肠道IgA。

　　这种菌苗还在恒河猴中进行试验。猴子间隔14天接种2剂1010空肠弯曲菌菌苗加0.5~1000μgLT，未见不良反应。部分动物在6周时接受1剂加强免疫。不管菌苗（福马林灭活）是否含LT，接种者对空肠弯曲菌的特异性T细胞应答均增强。由于初免程序后已获得最大应答，因此无需加强免疫。免疫后7天，IgA分泌细胞在含LT菌苗接种动物中增多。

　　第2种空肠弯曲菌菌苗已产生，目前正在进行Ⅱ期攻击研究评估。这种菌苗是利用能生产“抗原增强”菌苗的营养信号转导（NST）技术制备的。制备菌苗所用的细菌是通过专门方法培养的，其对INT-407和Ca-Co-2人肠上皮细胞的粘附力和侵袭力均增强，并在福马林灭活前与刚果红的结合力提高。这些表型被认为是空肠弯曲菌和其他肠道病原菌毒力和相关抗原表达的重要标志。为了获得这些特征，可将细菌置于含0.1%脱氧胆酸钠的脑心浸液肉汤中，37℃、10%CO2条件下培养至稳定期。

　　用上述细菌制备的NST菌苗在动物中的免疫原性强于传统方法制备的菌苗。NST菌苗免疫鼠肠道产生的抗原特异性IgA大于传统菌苗免疫鼠。口服含LT nST菌苗的雪貂产生的血清IgG水平比含佐剂传统菌苗免疫雪貂高15倍。用同源泉空肠弯曲菌口饲攻击雪貂，17%的NST菌苗免疫动物发病，而接受传统菌苗的动物的发病率达67%。

　　产肠毒素性大肠杆菌

　　产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是造成儿童严重脱水性腹泻的最主要细菌，估计每年发病4亿例，死亡70万例。ETEC是造成旅游者腹泻的主要原因，仅美国就影响800万人。表达定居因子CFA/Ⅰ和CFA/Ⅱ的ETEC经福马林灭活制成的菌苗已在人中进行评估。间隔2周口服3剂含或不含霍乱毒素B亚单位（CTB）的菌苗（1011个细菌/剂，5个菌毛型），免疫后7天检测外周血抗体分泌细胞（ASC）。对CFA/ cFA/Ⅰ和CFA/Ⅱ抗原产生应答的细胞主要是产生IgA的ASC，其次是IgM-ASC，IgG-ASC极少。2剂后的免疫应答最强。CTB不能增强对CFA/Ⅰ和CFA/Ⅱ抗原的应答。检得对CTB产生应答的IgA-ASC，IgG-ASC，未检得IgM-ASC，尽管对CFA的局部IgA应答极少与血清抗体水平的升高有关。在埃及进行的ETEC/重组CTB菌苗的研究中，74名21~45岁成人间隔2周接受2剂菌苗或安慰剂。受试者对CTB、CFA/Ⅰ、CS4、CS2和CS1的外周血IgA b细胞应答率显著高于对照者。对灭活WCV产生强免疫应答的发现是重要的，因为口服纯化的定居因子诱发的免疫应答微弱，且无保护作用。对菌苗的特异性T细胞应答也进行了评估。从接种者分离的人外周血单个核细胞中观察到中等度的CFA依赖性体 外增殖应答，用定居因子体外刺激应答细胞可产生高水平的γ干扰素（IFN-γ），未检得白细胞介素2（IL-2）。应答细胞主要是CD4+T细胞，CD8+细胞较少。高水平IFN-γ的产生可能具有免疫学意义。IFN-γ能刺激B细胞分泌抗体，增加肠细胞分泌组分的表达。这种类型的应答除产生IgA分泌细胞外，还能介导对ETEC攻击的防御作用。

　　受试者还接种了由大肠菌素E2处理灭活的ETEC菌苗。这种灭活方法能杀死菌苗，且不为化学或加热处理所改变。间隔1个月口服2剂此菌苗（3×1010个细菌）能在77%的接种者中诱导肠道抗CFA/ⅠIgA应答，86%的接种者产生增强的抗LT igA应答。接种者均能抵御同源和异源菌的攻击。

　　李斯德菌

　　单核细胞增多性李斯德杆菌是一种食物传播的病原体，人群罹患率较低，但在易感人群中的死亡率很高。最常影响的人群是孕妇或其他免疫损害者。

　　加热灭活的菌苗已在小鼠中进行评估。观察到的保护性免疫应答的标志是诱导细胞毒性T细胞和IFN-γ。在具有或缺少CD4+细胞的动物中均可诱导免疫应答，通过有免疫力动物CD8+细胞的导入可把免疫力移至无免疫力动物。菌苗是用在胰酷胨豆胨培养液中培养过夜、经70℃、60分钟加热灭活的细菌制备的。

　　沙门菌

　　在空肠弯曲菌检测前，沙门菌是美国引起胃肠炎的主要细菌，肠炎沙门菌仍是重要的病因。伤寒杆菌是伤寒的主要病因，全世界每年发病3000万例，死亡50多万例。加热灭活的鼠伤寒杆菌菌苗已在小鼠中进行试验，细菌在卢氏肉汤中培养至对数生长期，用沸水浴加热45分钟进行灭活。菌苗可经腹腔（ip）或皮内（id）途径给予。ip接种鼠的淋巴细胞增殖应答强于id接种鼠，但在免疫后42天降至相同水平。ip接种鼠脾细胞产生的IL-4和IL-2水平亦较高。此外，T细胞免疫印迹检测显示，ip接种动物能对不同分子大小的抗原产生应答，而id接种鼠主要对＜18kDa的抗原产生应答。

　　福马林、酚、丙酮灭活的鼠伤寒杆菌菌苗也在小鼠、大鼠和小牛中进行试验，小鼠免疫丙酮灭活的WCV产生抗脂多糖（LPS）和全菌体（WC）抗体。小鼠免疫野型光滑株或粗糙突变株（不能产生O抗原）制备的菌苗所获得的保护作用无差异。抵御致死攻击的短期保护作用与WC凝集滴度密切相关，而长期保护作用与之无关。大鼠免疫福马林灭活的菌苗能产生抗鼠伤寒杆菌抗体，且能抵御低水平的攻击，但无胸腺大鼠却不能，且能抵御低水平的攻击，但无胸腺大鼠却不能。用免疫动物的血清被动免疫无胸腺大鼠无效，而将免疫动物的脾细胞移给无胸腺大鼠则产生保护作用。这些研究提示，对菌苗的细胞介导免疫应答在抵御攻击时起重要作用。

　　志贺菌

　　志贺菌引起的痢疾在全世界均有发生，估计每年发病2.5亿例，死亡65万例。几项早期研究报道，一种灭活WCV能预防志贺菌病。有关这些菌苗组分的资料极少，但需口服大剂量才能奏 效。其他途径免疫有反应原性，且保护作用极小。在痢疾爆发地区给予人群口服免疫，并在这些现声研究中比较免疫人群与未免疫人群的罹患率。虽然这些研究没有很好的对照组，但显然菌苗有一定的保护作用。菌苗效力不佳部分由于这些口服WCV中并不存在高水平的相关抗原和难以刺激对死菌的口服免疫应答。

　　目前已制成NST福氏志贺菌菌苗，并在小鼠鼻攻击模型中进行试验。与制备传统菌苗的细菌相比，制备种菌苗的NST细菌具有对人肠道细胞更强烈的粘附和侵袭力，能产生较高水平的毒力相关蛋白，且与刚果红的结合水平提高。这种菌苗由福氏志贺菌2457T株构成，2457T株被培养于含0.1%脱氧胆酸钠的脑心浸液肉汤中，于37℃培养至对数生长早期，然后经福马林灭活。在凝集测定时，用NST培养的福氏志贺菌免疫家兔制备的兔超免疫抗血清能与同样培养的宋内志贺菌发生交叉反应。在小鼠模型中含LT的NST菌苗与EcSf2a-2减毒活菌苗的效力相同，且比传统方法制备的WCV更有效。

　　霍乱弧菌

　　霍乱是由霍乱弧菌引起的，主要特征是严重的脱水性腹泻，估计每年发病700万例，死亡10万多例。

　　已在动物和人中对霍乱WCV进行了大量 的研究，用堆乱WCV+CTB胃肠外免疫小鼠能抵御霍乱毒素（CT，2.25~3LD50）的攻击，这与免疫CVD103-Hg减毒活菌苗的结果相同：分别有100%和70%的小鼠能抵御2.25和3LD50的CT攻击。小鼠口服CT能诱生产生IgA应答的外周血淋巴细胞（PBL）。胃肠外免疫2剂类毒素或灭活菌苗的家兔能抵御活菌的攻击。胃肠外和口服途径一同给予类毒素和WCV均有协同作用和保护作用。

　　接种者间隔2周口服3剂菌苗（含加热灭活的稻叶型和小川型霍乱弧菌、福马林灭活的稻叶型和小川型ElTor弧菌各2.5×1010，有时含CTB），菌苗可被很好耐受，无副作用报告。口服2剂菌苗能诱导相似的IgA和IgG抗毒素和杀弧菌抗体应答。

　　用1×106个霍乱弧菌攻击，64%的WCV+CTB接种者获得保护，56%的WCV接种者获得保护，而对照组则90%发病。此外，发病的接种者的症状减轻。在孟加拉国的一项WCV现场研究中，2年内WCV的有效率为60%。在免疫成人中，3年中预防古典型霍乱的有效率为58%~76%，预防EITor型霍乱的有效率为48%~64%。菌苗在2~5岁儿童中的有效率为40%~56%，但预防ElTor型霍乱的效果较差。免疫接种后亦可观察到死亡率降低。霍乱菌苗含有与其他致病性弧菌发生交叉反应的抗原，但接种霍乱菌苗不能预防非霍乱弧菌感染，尽管接种组的罹患率较低。在CTB+霍乱弧菌全菌体（WC-BS）菌苗的现场试验中，免疫接种后能短期预防ETEC引起的腹泻。接受WC-BS菌苗的旅游者亦能预防ETEC引起的腹泻及ETEC与其他病原体的混合感染。

　　还对口服霍乱菌苗的免疫应答进行了评估。在瑞典志愿者中，在67%的口服单剂WC-BS菌苗者的肠灌洗液样本中检得升高的抗毒素IgA抗体，在93%的血清样本和64%的唾液样本中检得升高的抗毒素抗体，接种者对菌苗的应答情况与恢复期病人相仿。在孟加拉国现场试验期间，WCV和WCV+CTB接种者的杀弧菌抗体滴度升高1.3~2.1倍，免疫后7个月滴度有所回落，但保护作用可持续3年。接受1剂和3剂者的抗体滴度相近，但仅接受3剂者获得保护。接受CTB+WCV接种者的抗毒素滴度升高2.5~4.5倍。在其他研究中，在接受WCV者中，71%的接种者的杀弧菌抗体、57%的接种者的抗LPS和外膜蛋白（OMP）抗体、43%的接种者的抗血凝素抗体滴度升高4倍以上。在接受WC-BS者中，89%的接种者的杀弧菌抗体、68%的接种者的抗LPS和OMP抗体、32%接种者的抗毒素滴度升高4倍以上。在5~64岁接种者中，WCV+CTB均能显著提高IgG和IgA抗毒素和杀弧菌抗体滴度，而在4~12岁的接种者中仅抗毒素滴度升高。口服和胃肠外接种WC-BS菌苗均能诱生抗霍乱毒素的各类IgG和IgA1抗体，与恢复期病人产生的抗体相仿。反复免疫能诱生高水平的抗毒素IgG4抗体。免疫后检测接种者的PBL显示，口服免疫后的PBL主要产生IgA抗体，而胃肠外免疫后则主要产生IgG抗体应答，免疫后1年，接种者中存在产生抗毒素的PBL，且能产生以IgA和IgM同型为主的回忆应答。

　　霍乱弧菌灭活菌苗的制备方法可按NST空肠弯曲菌菌苗的制备方法加以改进。将霍乱弧菌569B株培养于含胆汁或脱氧胆酸钠的 蛋白胨牛肉浸膏培养基中，于37℃培养至对数生长早期，即其对人肠道细胞的粘附水平较高时，提示粘附素产生增加。此外，应用能构建超表达重要毒力相关抗原的菌株来制备福马林灭活的菌苗是极有希望的，在越南现场试验期间，用表达毒素共调节菌毛的霍乱弧菌制备WCV显示有效。

　　参考文献

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